【中英文題目】

An evaluation of the PacBio RS platform for sequencing and de novo assembly of a chloroplast genome

通過對葉綠體基因組的測序及從頭組裝對PacBio RS測序平臺進行評估

【基本信息】

期刊：BMC GENOMICS

IF：4.276

年份：2013

【摘要】

背景：二代測序技術已經可以為越來越多的非模式生物在全基因組水平上描述序列特征，但是，測序讀長較短，基因覆蓋區具有偏向性，后期組裝繁瑣。PacBio RS測序平臺增加了reads長度，基因覆蓋區無偏向性，因此，最終產生的基因組序列就擁有較少的gap和較長的contig。但是，三代測序的缺點是成本和錯誤率都較高。本次研究通過對Potentilla micrantha（委陵菜甘菊）葉綠體基因組的測序以及從頭組裝從而對PacBio RS測序平臺進行評價。

結果：從葉綠體基因組中一共得到28,638個PacBio RS reads，每個reads的平均長度為1,902bp, 測序深度為320×。對于單個contig，PacBio RS測序數據完全覆蓋了葉綠體基因組的154,959bp (100% coverage)，相比Illumina七個contig（90.59% coverage），而且，對于GC富集區域也并沒有明顯偏好性。后期序列的組裝與Illumina類似，允許在兩端的反向重復區域存在一些差異。

結論：本次研究是基于葉綠體基因組PacBio測序數據進行從頭組裝的第一次報道，用來組裝的PacBio數據只產生一個較大的contig，與Illumina相比，產生的reads較長并且具有較低的GC偏好性。研究表明，PacBio測序對于基因組研究具有很大的實用性，相比Illumina產生的短reads，它并不會產生很多gap和contig.

【研究思路】

取材：

Potentilla micrantha（以下簡稱P. micrantha）取自塞爾維亞的阿瓦拉山，將其帶回實驗室并在適宜條件下培養，促進其快速生長，之后，提取葉片DNA.

文庫構建：

分別利用PacBio RS和Illumina HiSeq2000對提取到的DNA進行建庫

測序策略：

Pacific Biosciences PacBio RS利用單分子實時（SMRT）測序技術?；HiSeq?測序系統既有Illumina和Solexa在邊合成邊測序上的優勢，又融合了最新的光學圖譜。

信息分析：

【研究結果】

1.Illumina HiSeq2000和PacBio?RS的測序數據

在進行誤差糾正之前，提取只包含葉綠體基因組的序列，PacBio RS reads的平均長度是3,936.66 bp, 一共含有223,483,907個核苷酸，經過HGAP誤差糾正之后，還有28,638個PacBio?RS reads平均長度為1,902.75 bp且一共含有54,492,250 bp核苷酸。經過修剪以后，Illumina reads一共含有7,164,496對，平均長度在99.22bp，一共含有核苷酸1,421,726,349個。

2.葉綠體基因組的組裝

PacBio RS與Illumina HiSeq2000所產生的數據以及序列的組裝的比較見圖1與表1

表1 P. micrantha葉綠體基因組的序列的統計

使用PacBio RS和Illumina HiSeq2000得到的P. Micrantha葉綠體基因組的測序數據匯總統計

1表示修建的Illumina reads

2表示誤差修正的PacBio reads和原始的Illumina reads

3表示與葉綠體一致性序列的比較

圖1?P. micrantha葉綠體基因組的序列覆蓋范圍?示意圖顯示的是將P. micrantha葉綠體基因組通過ABySS和Celera?assembler組裝得到的Illumina（黑色）和PacBio（綠色）contigs. 示意圖最上面的紅色的線條表示的是葉綠體基因，藍色加粗的區域表示的是基因組中反向重復的區域，Illumina和PacBio組裝得到的contig 1中并非IR唯一的部分用紅色表示出來

?3.覆蓋深度和GC偏好性

PacBio和Illumina?reads分別覆蓋了P. micrantha葉綠體基因組的100%和99.6%的，Illumina組裝后含有低覆蓋度的區域（圖2），意味著7個contigs只是覆蓋了葉綠體一致性基因組的90.59%（圖1）；PacBio數據則明顯更為均勻（圖2），并且僅僅組裝成一個contig, 也是形成葉綠體一致性序列的基礎（圖1）。圖2展示的是PacBio和Illumina在葉綠體基因上的每個堿基的覆蓋度，表明PacBio RS的測序結果表現出更加均勻的覆蓋度。

圖2 P. micrantha葉綠體基因組序列每個堿基的覆蓋范圍?圖中顯示的是葉綠體基因組的每個堿基之間的測序深度，(a)表示Illumina (黑色)和PacBio (綠色)測序數據 (b)表示只有PacBio測序數據，反映出的是PacBio測序數據盡管大大降低了覆蓋度，但是在基因組上的覆蓋相對均勻，對于Illumina測序數據，還含有很低甚至是0覆蓋度。此外，兩個數據集中顯著較高覆蓋度的是反向重復序列。

為了檢測GC偏性是否存在于這兩類測序結果中，文章對平均覆蓋度和GC百分含量做了相關性分析，在計算的過程中，排除了反向重復序列。計算得到的PacBio和Illumina數據集的皮爾森系數分別是0.23 (p-value = 5.675e-09)以及0.61 (p-value = 2.2e-16)，因此，Illumina數據集中平均覆蓋度和GC百分含量表現出很強的相關性（圖3）。

圖3??Illumina and PacBio測序數據集的GC偏性的計算?分別根據(a) Illumina（黑色）(b) PacBio（綠色）測序數據中，含157個核苷酸的987個窗口的平均測序深度，計算GC含量并作圖，結果表明，Illumina數據（皮爾森相關系數= 0.61，p值?= 2.2e-16）比PacBio數據（皮爾森相關系數= 0.23，p值?= 5.675e-09）顯示出與GC含量的更強的相關性，排除反向重復序列的高覆蓋度數據。

?4.錯誤率

組裝前的PacBio RS reads與P. micrantha葉綠體基因組一致性序列相比較，其錯誤率為1.3%，而Illumina reads的錯誤率僅是0.117%.

?5.葉綠體基因組針對不同測序深度的組裝

為了了解使用PacBio RS測序數據時，測序深度對于P. micrantha基因組組裝的影響，使用10×, 20×, 35×, 50×,100×, 150×和200×的樣本數據，將每個數據集進行組裝，7個組裝裝好的數據集中，有5個(從?200×到35×)得到的是單個的contig, 同時，測序深度為20× 的數據集得到4個contigs覆蓋基因組的95.6%，測序深度為10×的數據集得到的是14個contigs覆蓋基因組的78.2%. 為了進行比較，Illumina測序數據取與PacBio相同的7個測序深度的樣本數據，并進行組裝，但是，與9111×測序深度相比，并沒有得到比較完整的組裝。

?6.?P. micrantha葉綠體基因組的結構

組裝好的P. micrantha葉綠體基因組長154,959 bp（圖4）, 反向重復序列(IR)?25,530 bp, 大的單一重復區(LSC)和小的單一重復區域(SSC)分別長85,137 bp和18,762 bp. P. micrantha葉綠體基因組共包含了120個基因，有141個基因功能已知。其中，31個是tRNA編碼基因,7個位于IR區。

圖4 ?P. micrantha葉綠體基因組序列??P. micrantha葉綠體基因組基因含量的結構圖，外圈內側表示基因順時針轉錄，外圈外側表示基因逆時針轉錄，根據不同的功能將基因帶有不同的顏色；內圈表示基因組的平均GC含量。IRa和IRb表示反向重復區域，LSC和SSC分別表示長重復區域和短重復區域。基因圖譜經OGDRAW繪制。

【研究結論】

1、 文章第一次報道了使用PacBio RS測序平臺對葉綠體基因組的從頭測序與組裝，為了更好地評價PacBio RS測序結果，文章還將其與Illumina HiSeq2000測序平臺的測序結果進行了比較。

2、 研究表明，PacBio測序對于基因組研究具有很大的實用性，相比Illumina產生的短reads并且具有GC偏好性低，它并不會產生很多gap和contig.

3、 PacBio RS測序技術有利于完成不同真核生物高質量的測序。

【所用軟件及數據庫】

SMALT：序列比對工具，文中用來過濾和提取葉綠體DNA reads

AbySS：序列的拼接與組裝是基因組測序數據處理中一個至關重要的步驟，AbySS是用于高通量測序序列拼接與組裝的軟件

CD-Hit：通過序列比對聚類（Cluster）的方法去除冗除、相似的序列，最后輸出一個非冗除（non-redundant，nr）的序列文件

SMRT：Pacific Biosciences公司的SMRT技術，作為第三代測序技術，與前兩代技術相比，其最大的特點是單分子測序

DOGMA：基因組注釋工具

OGDRAW：在基因組學研究中，用于畫一個小的環形基因組，例如線粒體、葉綠體、質粒的圈圖

CORAL：糾正下一代測序數據錯誤率的工具